SBP基因家族属于植物所特有的转录因子，是一类能够在mRNA转录水平上调节基因表达的DNA结合蛋白质(Xiong et al., 2005)。目前，SBP转录因子已在许多植物中被鉴定，并且具有多种功能(Becraft et al., 1990; Cardon et al., 1997; Lännenpää et al., 2004; Shao et al., 1999, http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/rgn/vol16/v16p114.html)。在拟南芥中，研究发现SBP8和SBP14基因分别与调控花粉的发育和真菌毒素 FB1 诱导的程序性死亡的抗性相关(Schmid et al., 2003;Unte et al., 2003)。玉米中的LG1 (SBP基因)涉及玉米的叶耳和叶舌的形成(Becraft et al., 1990)，TGA1 (SBP基因)的启动子和编码序列中几个核苷酸与玉米的花序结构相关(Wang et al., 2005)。由此看出，SBP转录因子在植物中不仅广泛存在，而且在植物生长和花发育中具有重要的作用。研究发现SBP蛋白中包含一段高度保守的DNA结构域，大约编码79个氨基酸残基，被称之为SBP结构域。这一结构域的特点是包含两个锌指结构(Yamasaki et al., 2004)和双向核定位信号(nuclear localization signal, NLS) (Birkenbihl et al., 2005)。对这些结构特征的揭示有助于进一步解析它们在高等植物生长发育的调控作用。

随着越来越多的植物基因组测序的完成，SBP转录因子家族在全基因组范围内已经被广泛地鉴定。Birkenbihl等(2005)和Yang等(2008)在模式植物拟南芥和水稻中分别发现了16个和19个SBP-box基因；随后，相继在葡萄、苹果、大豆和草莓全基因组水平上鉴定出SBP-box转录因子(曹雪等, 2010; 刘更森等, 2011; 朱命喜等, 2011; 葛安静等, 2012)。番茄基因组测序的完成为加快番茄的遗传育种和分子生物学研究提供了机遇(The Tomato Genome Consortium, 2012)。目前，关于番茄中SBP基因的信息还比较少，仅Manning等(2006)从番茄中分离了1个SBP基因(LeSPL-CNR)，鉴定其是控制果实发育的关键基因。

本研究在番茄全基因组信息的基础上，利用生物信息学方法鉴定了SBP基因家族的成员，揭示了内含子-外显子结构特征，染色体定位及其表达分析，进一步结合拟南芥、水稻SBP家族基因成员，分析植物中SBP蛋白的进化关系。为揭示番茄SBP基因家族成员的功能奠定理论基础。

1结果和分析
1.1番茄SBP基因家族成员的鉴定和特征
为了尽可能全面鉴定番茄SBP基因家族成员，运用两种模式植物(水稻和拟南芥)的SBP基因家族成员为靶序列，对含有番茄基因组数据库的网站http://mips.helmholtz-muenchen.de/plant/tomato/searchjsp/index.jsp和http://solgenomics.net/进行BLAST检索。共获得17条番茄SBP基因家族成员(SlSBP01~SlSBP17)，这些基因的氨基酸长度变异比较大，从133aa (SlSBP12)~1045aa (SlSBP10)之间；分子量大小介于15.04~115.75 kD；然而，这些基因的理论等电点相对变异较小，位于5.80 (SlSBP01)~9.79 (SlSBP11)之间；内含子数目变异比较大，位于1 (SlSBP11, SlSBP12, SlSBP13和SlSBP17)~11 (SlSBP10)之间(表1)。

表1 番茄SBP基因家族信息 Table 1 Information of SBP gene family in tomato

1.2番茄SBP转录因子‘SBP’结构域比对及SBP蛋白的内含子-外显子结构分析
通过Pfam网站鉴定了番茄SBP基因的‘SBP’保守结构域，运用软件BioEdit软件中的Clustal X程序进行了多序列比对；结果显示，除了SlSBP06之外，每一个番茄SlSBP基因‘SBP’结构域含有大约79个氨基酸残基(图1)，具有2个锌指结构，分别为C3H(C-C-C-H)和C2HC(C-C-H-C)类型(Birkenbihl et al., 2005)。此外，在‘SBP’保守结构域的C端，还具有一个核定为信号(nuclear localization signal, NLS)，它是植物转录因子的一个特征(Birkenbihl et al., 2005)。在SlSBP06中，仅仅含有第二个锌指结构C2HC，第一个锌指结构发生了缺失和突变。其余的SlSBP都具有完全保守的‘SBP’结构域。

图1 番茄SBP基因家族成员DNA结构域的序列比对 Figure 1 The DNA conserved domain sequence alignment of the SlSBP gene family members

为了分析番茄SlSBP基因的结构特征，我们构建了SlSBP基因系统发育树和内含子-外显子结构图(图2)。番茄SBP基因家族成员可以分为5类(Ⅰ-Ⅴ)，每一类包含不同数目的成员；内含子-外显子结构图显示，番茄SlSBP基因之间，含有的内含子数目变异比较大，最多的含有11个(SlSBP10)，最少的含有1个内含子(SlSBP11, SlSBP12, SlSBP13和SlSBP17)。

图2 番茄SBP蛋白系统发育树的构建和内含子-外显子结构特征 Figure 2 Phylogenetic tree construction and intron-exon structure of SlSBP proteins

Ⅰ类成员含有的内含子数目均为2个，Ⅱ类成员含有3个，Ⅲ类成员为1~2个，而Ⅳ类成员含有9或者11个，内含子的数目与系统发育树存在对应关系。此外，还可以看出，除了少部分基因以外，大部分的基因都有5’和3’非编码区(5’-UTR和3’-UTR)。3个基因SlSBP14、SlSBP15和SlSBP16不含有UTR，SlSBP11和SlSBP05分别缺失3’-UTR和5’-UTR。

1.3番茄、水稻和拟南芥SBP转录因子家族的系统发育关系
为了分析番茄SBP基因家族的进化关系，水稻和拟南芥的SBP基因被选择用来构建系统发育树(图3)。3个物种的SBP基因家族成员被分为3个区组(A组, B组和C组)，每一组都包含有来自三个物种的成员。基于高的Boostrap值，三组SBP家族成员被进一步10个亚组。

图3 番茄, 水稻和拟南芥SBP蛋白的系统发育关系 Figure 3 Phylogenetic relationships of SBP proteins from tomato, rice and Arabidopsis

此外，仅仅2对物种间的直系同源蛋白被鉴定(SlSBP07和AtSBP06, SlSBP02和AtSBP07)，而物种内存在13对旁系同源蛋白，分别为来自拟南芥的AtSBP01和AtSBP12，AtSBP14和AtSBP16，AtSBP04和AtSBP05，AtSBP09和AtSBP15，AtSBP10和AtSBP11；来自水稻的OsSBP05和OsSBP10，OsSBP14和OsSBP17，OsSBP16和OsSBP18, OsSBP04和OsSBP11，来自番茄的SlSBP10和SlSBP15，SlSBP03和SlSBP14，SlSBP04和SlSBP16，SlSBP03和SlSBP08。结果发现，50%的SBP蛋白以物种内同源蛋白形式存在。

1.4番茄SBP转录因子的染色体定位
根据茄科数据库网站SGN提供的番茄基因组信息，绘制了SlSBP基因在染色体的分布模式图(图4)。番茄所有SBP基因分布在8条染色体上，在4条染色体(6, 8, 9和11)上没有分布。2，3和12号染色体分别分布1个SBP基因(SlSBP17, SlSBP04和SlSBP16)，而5号染色体上分布最多，达到4个SBP基因(SlSBP07, SlSBP08, SlSBP09和SlSBP10)。

图4 番茄SBP基因的染色体定位 Figure 4 Chromosome mapping of SBP genes in tomato

1.5番茄SBP转录因子的表达分析
为了分析SlSBP基因的表达模式，利用番茄功能基因组数据库中公布的美国昂飞公司番茄芯片(Affymetrix tomato genome array)表达结果进行分析。这些芯片包括番茄不同组织类型(图5A)、病菌胁迫、干旱胁迫和盐胁迫(图5B)的表达量。在17个番茄SBP转录因子中，共筛选出6个SBP基因(SlSBP01, SlSBP03, SlSBP06, SlSBP11, SlSBP13和SlSBP16)具有相应的探针(LesAffx.56390.2.S1_at, LesAffx.49534.1.S1_at, Les.1925.1.A1_at, Les.2707.1.S1_at, Les.3065.1.S1_at和Les.2091.1.S1_at)。图5A显示表达的部位和组织类型依次为黄色果皮、红色果皮、橙色果皮、根、绿果果皮、子叶、第三片真叶、生长三周的叶片、生长五周的叶片、下胚轴、绿色果肉、黄色果肉、橙色果肉和红色果肉。图5B显示表达生物和非生物胁迫类型处理样品依次为在开花期热敏感番茄热胁迫处理叶片、不耐干旱番茄进行干旱胁迫处理叶片、耐干旱番茄进行干旱处理叶片、盐胁迫处理叶片、真菌激活子处理4天叶片，真菌激活子处理8天叶片、开花期耐热番茄热胁迫处理叶片、葡萄孢菌侵染番茄绿色果实样品、番茄溃疡病菌侵染番茄4天叶片、番茄溃疡病菌侵染番茄8天叶片和葡萄孢菌侵染番茄红色果实样品。

从图5A可以看出，在6个基因中，SlSBP03基因在番茄叶片、子叶和下胚轴中表达量较高，SlSBP13基因果肉中表达量较高，这两个基因在果皮和根中表达量都较低；然而SlSBP16基因在果肉中表达量较低；SlSBP11基因在根、叶片和下胚轴中表达量较低；其余两个基因表达量没有显著变化。另外，从图5B可以看出，在非生物胁迫处理中，除了耐热番茄热胁迫外，SlSBP11、SlSBP13和SlSBP16的表达量大多数均较低；SlSBP01基因在干旱和热胁迫处理条件下有较高的表达量；SlSBP03基因在盐、真菌激活子和耐干旱番茄在干旱胁迫处理条件下表达量较低；番茄溃疡病菌处理叶片均不能诱导这6个基因的表达变化。

图5 番茄SBP基因表达图谱 Figure 5 Expression profiles of SBP genes in tomato

2讨论
朱命喜等(2011)报道SBP基因家族是植物特异的一类转录因子家族，广泛地参与到植物生长发育、代谢调控以及对逆境的胁迫反应，如花、果实和孢子发育、激素应答以及抗病菌侵染等。本研究应用生物信息学方法从番茄基因组数据库中共鉴定17个SBP转录因子家族成员，都含有高度保守的“SBP”结构域。先前研究者Salinas等(2012)从番茄中搜索出15个成员，这种差异可能是我们搜索SBP基因过程中选择了两个不同的番茄基因组数据库缘故。因此，本研究获得的数据更为全面，结果更为可靠。然而，与葡萄(曹雪等, 2010)、苹果(刘更森等, 2011)和大豆(朱命喜等, 2011)相比，番茄SBP转录因子家族具有相对少的数目，这种现象在拟南芥(Yang et al., 2008)、水稻(Yang et al., 2008)和草莓(葛安静等, 2012)也存在。

构建系统发育树不仅有助于分析基因间的进化关系，还帮助寻找物种间直系同源和物种内旁系同源基因。本研究以拟南芥、水稻和番茄共52个SBP基因构建了系统发育树(图3)，从系统发生树可以看出，番茄、拟南芥和水稻的SBP基因家族被分成了3个家族，并且番茄、拟南芥和水稻的SBP转录因子在每一个家族中均有分布。这表明这一基因家族的基本特征的形成早于单子叶与双子叶植物分化。此外，为了分析物种内和物种间SBP基因家族成员之间的关系，三组SBP家族成员被进一步10个亚组，所有亚组Boostrap值都比较高，表明每一组成员可能存在相似的起源方式。

另外，本研究仅发现2对直系同源基因(SlSBP07和AtSBP06, SlSBP02和AtSBP07)，而在番茄、拟南芥和水稻基因组中发现13对旁系同源SBP基因，表明这些基因家族在各自的物种中(番茄, 拟南芥和水稻)，按照各自物种特异性的方式进行了扩展。此种现象在植物其他基因家族的研究中也得到了广泛的验证(Bai et al., 2002; Zhang et al., 2005; Jain et al., 2006)。

本研究揭示了番茄SBP基因不仅参与根、子叶，真叶等营养器官的生长发育，而且涉及盐、干旱、热处理以及病菌处理的反应，表明这些基因在番茄的生长发育中具有重要的作用，参与番茄对外界生物胁迫和非生物胁迫反应，为更深入了解SBP基因功能奠定了基础。

3材料和方法
3.1材料
本研究所用的水稻和拟南芥的SBP蛋白序列来源于植物转录因子数据PlnTFDB (Plant transcription factor database)网站(http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/)。拟南芥和水稻全基因组分别编码16个和19个SBP转录因子。

3.2番茄SBP转录因子的鉴定
 首先，对拟南芥和水稻的SBP转录因子进行Pfam网站(http://pfam.janelia.org/)鉴定，获得高度保守的“SBP”结构域，下载并保存此结构域；然后分别以拟南芥和水稻SBP转录因子的“SBP”保守结构域为检索序列，对番茄全基因组序列网站http://mips.helmholtz-muenchen.de/plant/tomato/searchjsp/index.jsp和http://solgenomics.net/进行BLAST检索，E<1e^-20，手工去除重复序列。最后，将这些候选基因编码的蛋白通过PFAM网站鉴定是否存在“SBP”结构域，存在即属于番茄SBP蛋白家族。此外，通过网站http://web.expasy.org/compute_pi/计算番茄SBP基因的分子量和理论等电点值。

3.3番茄SBP蛋白DNA结合域多序列比对及其内含子-外显子结构特征
 通过PFAM网站鉴定已获得的这些候选基因的“SBP”结构域(DNA结合域)，利用软件BioXM2.6将这些基因DNA结构域文件格式修改为FASTA格式，再导入Clustal X软件，使文件格式转换为“Clustal”格式，后利用BioEdit软件进行多序列联配。根据茄科网站(http://solgenomics.net/)番茄基因组信息，下载每一个SBP转录因子的基因组序列，结合编码该基因的核苷酸序列，通过BioXM2.6软件比对分析番茄SBP转录因子内含子的数目，进一步将这两种序列的文件格式转换为FASTA文件格式，再利用网站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在线工具GSDS (郭安源等, 2007)绘制SBP基因的外显子-内含子结构图。

3.4番茄SBP转录因子的系统发育关系
为了揭示植物中SBP基因的进化关系，模式植物拟南芥、水稻的SBP转录因子也被选择用来一起分析。首先将拟南芥、水稻和番茄SBP蛋白的氨基酸序列用FASTA格式保存；然后使用MEGA5.05软件(Tamura et al., 2011)对其进行多重序列比对(使用蛋白序列比对默认值)，并将其转换成‘MEG’文件格式，最后用邻接法(Pairwise Deletion处理缺失数据, P-distance模型, Bootstrap检验1 000次)重建系统发育树，去除Bootstrap支持率低于50%的节点，并显示各分支长度。

3.5番茄SBP基因的染色体定位及表达分析
根据茄科网站(http://solgenomics.net/)番茄基因组信息，分析每一个SBP转录因子在番茄染色体的位置，利用软件MapDraw V2.1绘制SBP基因染色体分布图。此外，依据番茄已经发表的基因芯片(Affymetrix番茄基因表达芯片)数据，检测SBP转录因子在番茄不同组织、生物胁迫和非生物胁迫条件下的表达情况。从番茄功能基因组数据库TFGD (http://ted.bti.cornell.edu)网站下载六张芯片的表达结果，编号分别为E023 (真菌激活子生物胁迫)、E024 (番茄溃疡病菌胁迫)、E031 (葡萄孢菌胁迫)、E037 (番茄不同组织类型)、E051 (番茄盐胁迫)和E053 (番茄开花期热, 干旱胁迫)，利用ClusterProject软件(Pan et al., 2005)制作基因表达谱。

作者贡献
万红建、袁伟和俞锞是本研究的实验设计和实验研究的执行人；阮美颖、姚祝平、周国治和叶青静参与论文写作与修改；李志邈、王荣青和刘云飞参与实验设计，试验结果分析；杨悦俭是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(31071800)、浙江省自然科学基金(LQ12C150020)、浙江省农业新品种选育重大科技专项(2012C12903)、国家大宗蔬菜产业技术体系(CARS-25-G-16)和浙江省公益技术研究农业项目(2011C22007)共同资助。

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